RNA免疫沉淀方案


         RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)技术是一种专门用于研究细胞内RNA与蛋白质相互作用的实验方法,用于绘制体内RNA-蛋白质相互作用和RNA修饰(如m6A和ac4C)。这项技术基于RNA与蛋白质的特异性结合,通过使用特定抗体富集含有与目标RNA结合蛋白(RNA binding Protein, RBP)的RNA分子,揭示RNA与蛋白质的相互作用关系,从而了解特定RNA的调控机制或参与的生物学过程。

 

         RIP技术允许研究者探索转录后调控网络的动态过程,并有助于发现miRNA的调节靶点。通过这种方法,可以鉴定与特定RNA结合蛋白相关的核酸,包括mRNA、非编码RNA(如长非编码RNA、增强子RNA、miRNA)和病毒RNA。

 

 

第 1 阶段   细胞采集和细胞核分离

 

1.使细胞生长至汇合,如果需要进行交联步骤,则需要优化固定时间。

 

2.吸除培养基,用冰冷的PBS洗涤细胞两次,以去除培养基和其他杂质。

 

3.通过胰蛋白酶消化收集细胞并在PBS(例如,107个细胞使用2 mL PBS)、新鲜制备的细胞核分离缓冲液(2 mL)和水(6 mL)中重新悬浮。冰上放置20分钟(不时搅拌)。

 

4.在4℃下以2,500 g的速度离心15分钟,沉淀细胞核。

 

5.将核沉淀重悬于1 mL新鲜配制的RIP缓冲液中。使用不含RNase试剂(如不含RNase的枪头、试管和试剂瓶)避免造成污染;还要使用超纯蒸馏水、不含DNase和RNase的水来制备缓冲液和溶液。

 

6.(可选)取10 µl蛋白裂解液标记“Input”,存放在-80℃冰箱中直到进行第5步实验时取出,与IP样品同步进行RNA纯化实验。

 

 

第 2 阶段   染色质剪切

 

1.将悬浮的细胞核分成两部分,每部分500 µL,一份用于模拟实验,另一部分用于IP。

 

2.使用匀浆器以15-20次的速度机械剪切染色质。

 

3.以13,000-16,000 ×g的速度离心10分钟,沉淀核膜和碎片。将一份裂解物冷冻在液氮中,为RNA分离做对照。

 

 

第3阶段   RNA免疫沉淀

 

1.于上清液(6-10 mg)中添加2-10 ug目的蛋白的抗体,4℃轻轻旋转孵育2小时或者过夜。

 

2.加入40 µL蛋白A/G磁珠并在4℃下轻轻旋转孵育1小时。

 

 

第 4 阶段   洗涤

 

1.以2,500 rpm离心30 s沉淀磁珠,去除上清液,然后用500 µL RIP缓冲液重新悬浮磁珠。

 

2.用RIP缓冲液重复清洗三次,然后再用PBS清洗一次。第二次清洗后,冷冻5%的磁珠用于SDS-PAGE分析(例如,如果总磁珠浆体积为100 µL,则使用5 µL磁珠浆)。

 

 

第 5 阶段   纯化

 

1.添加1 mL TRIzol RNA提取试剂重新重悬磁珠,以分离共沉淀的RNA。

 

2.用20 µL(15 - 25 µL,具体用量取决于产量)DEPC处理的TE缓冲液或不含核酸酶的水洗脱RNA。洗脱的RNA可储存在-80°C下。

 

3.用磁珠分离的蛋白质可用Western blot分析检测。可参见我们的蛋白质印迹实验方案

 

4.如果已使用交联步骤,则现在应逆转交联。

 

 

第 6 阶段   结果分析

 

1.使用DNA逆转录酶,将纯化的RNA逆转录为cDNA。

 

2 .如果已知靶标,可直接通过cDNA的qPCR进行分析。如果靶标未知,则可以通过建立cDNA文库、微阵列和测序进行分析。

 

         对照实验在PCR扩增后应当不会产生可检测的产物,并且这些对照文库的高通量测序应当返回非常少的独特序列。


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