蛋白质印迹的裂解物制备法
本方法为裂解物和缓冲液制备配方,用于裂解细胞或组织进行蛋白质印迹分析。
缓冲液配方如下:
(1)1×1% SDS热裂解液缓冲液
- 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)
- 1% SDS
- 1 mM原钒酸钠
- ddH2O
(2)2×样品缓冲液
- 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8)
- 2% SDS
- 0.01% 溴酚蓝
- 25%甘油
- 710 mM β-巯基乙醇
- ddH2O
• 细胞样本
一、1% SDS热裂解液缓冲液制备(变性)
实验步骤
1.弃掉培养瓶中的培养基,用预冷的PBS清洗一次。
2.每个培养瓶加入3 ml预冷的PBS,用细胞刮刀收集细胞。
3.加入12 ml预冷的PBS,确保所有细胞均从培养瓶中脱落。
4 .将收集的细胞转移到50 ml离心管中,300 ×g离心5分钟。
5.弃上清,用预冷的PBS洗涤两次。
6.加热1% SDS热裂解直至起泡。
7.用移液器加入1%SDS热细胞裂解液,重悬细胞,放置10至20分钟。
8 .使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。
9.以15000-17000 ×g的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。
实验步骤
1.弃掉培养瓶中的培养基,用预冷的PBS清洗一次。
2.每个培养瓶加入3 ml预冷的PBS,用细胞刮刀收集细胞。
3.加入12 ml预冷的PBS,确保所有细胞均从培养瓶中脱离。
4 .将收集的细胞转移到50 ml 离心管中,300 ×g离心5-10分钟。
5.弃上清,用预冷的PBS洗涤两次。
6.根据细胞量加入RIPA Buffer,重悬细胞。放在冰上15分钟。
7 .使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般建议超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。
8.以15000-17000 ×g的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。
• 组织样本
一、 1% SDS热裂解液缓冲液制备(变性)
实验步骤
1.用预冷剪刀将冷冻的组织剪碎。然后用预冷的研钵将组织研磨成粉末。
2.加热1% SDS热裂解直至起泡。
3.用移液枪加入1% SDS热细胞裂解液,重悬细胞。放置10至20分钟。
4.使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。
5.以 15000-17000 ×g 的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。
二、RIPA 裂解物制备
实验步骤
1.用预冷剪刀将冷冻的组织剪碎。然后用组织研磨仪将组织研磨成粉末。
2.根据组织量加入RIPA缓冲液,重新悬浮组织。放在冰上15分钟。
3.使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。
4.300 ×g离心5-10分钟,弃去组织沉淀。
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