蛋白质印迹的裂解物制备法

        

        本方法为裂解物和缓冲液制备配方,用于裂解细胞或组织进行蛋白质印迹分析。

 

缓冲液配方如下:

(1)1×1% SDS热裂解液缓冲液

- 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)

- 1% SDS

- 1 mM原钒酸钠

- ddH2O

(2)2×样品缓冲液

- 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8)

- 2% SDS

- 0.01% 溴酚蓝

- 25%甘油

- 710 mM β-巯基乙醇

- ddH2O

 

•   细胞样本

 

一、1% SDS热裂解液缓冲液制备(变性)

 

实验步骤

 

1.弃掉培养瓶中的培养基,用预冷的PBS清洗一次。

 

2.每个培养瓶加入3 ml预冷的PBS,用细胞刮刀收集细胞。

 

3.加入12 ml预冷的PBS,确保所有细胞均从培养瓶中脱落。

 

4 .将收集的细胞转移到50 ml离心管中,300 ×g离心5分钟。

 

5.弃上清,用预冷的PBS洗涤两次。

 

6.加热1% SDS热裂解直至起泡。

 

7.用移液器加入1%SDS热细胞裂解液,重悬细胞,放置10至20分钟。

 

8 .使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。

 

9.以15000-17000 ×g的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。

 

二、RIPA 裂解物制备

 

实验步骤

 

1.弃掉培养瓶中的培养基,用预冷的PBS清洗一次。

 

2.每个培养瓶加入3 ml预冷的PBS,用细胞刮刀收集细胞。

 

3.加入12 ml预冷的PBS,确保所有细胞均从培养瓶中脱离。

 

4 .将收集的细胞转移到50 ml 离心管中,300 ×g离心5-10分钟。

 

5.弃上清,用预冷的PBS洗涤两次。

 

6.根据细胞量加入RIPA Buffer,重悬细胞。放在冰上15分钟。

 

7 .使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般建议超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。

 

8.以15000-17000 ×g的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。

 

•   组织样本

 

一、 1% SDS热裂解液缓冲液制备(变性)

 

实验步骤

 

1.用预冷剪刀将冷冻的组织剪碎。然后用预冷的研钵将组织研磨成粉末。

 

2.加热1% SDS热裂解直至起泡。

 

3.用移液枪加入1% SDS热细胞裂解液,重悬细胞。放置10至20分钟。

 

4.使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。

 

5.以 15000-17000 ×g 的速度离心5-10分钟,丢弃细胞沉淀。

 

二、RIPA 裂解物制备

 

实验步骤

 

1.用预冷剪刀将冷冻的组织剪碎。然后用组织研磨仪将组织研磨成粉末。

 

2.根据组织量加入RIPA缓冲液,重新悬浮组织。放在冰上15分钟。

 

3.使用超声波细胞破碎仪破碎所有细胞团块,直至裂解液变得清澈。一般超声时间3 s,间隔10 s,超声5-15次,超声功率:40 kW。

 

4.300 ×g离心5-10分钟,弃去组织沉淀。

 

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