天然蛋白免疫沉淀法
天然蛋白的免疫沉淀技术是一种用于研究天然蛋白质相互作用的经典方法,它依赖于抗体与蛋白(抗原)之间的特异性结合。这种技术可以用于定性检测蛋白质,确定蛋白质在细胞内生理性作用,以及发现新的结合蛋白。
本实验方案主要介绍了利用蛋白质免疫印迹法来分析天然蛋白的过程。
一、 制备细胞裂解物
所需溶液与试剂
注:利用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
(1)1 L 20×磷酸盐缓冲液(PBS):
将50 ml 20×PBS加入到950 ml dH2O中,充分混匀。
(2)10 ml 10×细胞裂解缓冲液:
将1 ml 10×细胞裂解缓冲液加入到9 ml dH2O 中,充分混匀。注意使用前,需要加入1 mM PMSF。
(3)3×SDS样品缓冲液:
通过添加1/10体积的30×DTT至1体积的3×SDS上样缓冲液,制备新鲜的3×还原上样缓冲液。
实验操作
1.吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
2.去除培养基后用冰预冷的1×PBS洗涤细胞一次。
3.去除PBS,每块10 cm细胞板添加0.5 ml冰冷的1×细胞裂解缓冲液,并置于冰上孵育5分钟。
4.从板上刮下细胞,并转移至微量离心管,置于冰上。
5.在冰上进行超声破碎3次,每次5秒。
6.在4℃,14,000 × g条件下,微量离心10分钟,
7.将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如暂时不进行后续操作,裂解物可保存在-80℃。
二、细胞裂解物预清除(可选)
所需溶液与试剂
使用蛋白A和蛋白G分别进行兔IgG免疫沉淀和小鼠IgG免疫沉淀。
(2)固定的链霉亲和素(偶联磁珠)(针对生物素化抗体):
轻柔涡旋振荡小瓶,并在每次免疫沉淀法中使用10 µl。
实验步骤
注意:强烈建议使用相应的同型对照抗体,以便区分特异性识别或是非特异性结合。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
1.向浓度为1 mg/ml的200 μl细胞裂解物中添加20 μl蛋白A或蛋白G琼脂糖50%珠浆、10 μl Streptavidin(UltraBio™ Streptavidin Magnetic Beads)进行生物素化抗体检测。4℃旋转孵育30-60分钟。
2.4℃条件下微量离心10分钟。
3.将上清转移到新管中。然后根据所使用的一抗,继续下述实验操作。
三、抗体孵育
● 非偶联一抗
1.将一抗(按产品数据表中建议的合适稀释比例)添加到200 µl细胞裂解物中。轻柔震荡下4℃过夜孵育。
2.添加蛋白A或蛋白G琼脂糖(20 µl 50%珠浆)。轻轻摇动,并在4℃下孵育1-3小时。
3.4℃条件下微量离心30秒。
4.用500 µl的1×细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。注意洗涤间期,保持样品于冰上。
● 生物素偶联一抗
1.将生物素偶联抗体(按产品数据表中建议的合适稀释比例)添加到200 µl细胞裂解物中。轻柔震荡下4℃过夜孵育。
2.轻柔混匀固定化的 Streptavidin(UltraBio™ Streptavidin Magnetic Beads),并加入10 µl珠浆。轻柔震荡下,在4℃孵育2小时。
3.4℃条件下微量离心30秒。
4.用500 µl的1×细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
四、蛋白免疫印迹法进行样品分析
注:勿离心磁珠。应使用磁性分离架。
1.在20-40 µl 3×SDS样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡,然后再微量离心30秒。
2.将样品加热至95-100℃并持续2-5分钟,然后在14,000 × g下瞬时离心1分钟。
3.将15-30 µl样品上样到SDS-PAGE凝胶上。蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质印迹通用实验方案)。
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