免疫荧光染色实验步骤(甲醇通透法)
免疫荧光染色技术是一种广泛应用于生物医学研究中的显微技术,它通过利用特异性抗体与目标抗原的结合,并借助荧光标记进行可视化,从而在细胞或组织水平上检测和定位特定的蛋白质。这种技术因其高灵敏度和特异性,在细胞生物学、病理学、免疫学等多个领域中扮演着不可或缺的角色,为研究者提供了一种强大的工具来探索细胞结构和功能。
免疫荧光染色的基本原理基于抗原-抗体反应,其中特异性的第一抗体(一抗)识别并结合目标抗原,随后第二抗体(二抗)与第一抗体结合,并且二抗上连接有荧光分子。这种荧光标记使得通过荧光显微镜可以直观地观察到抗原的位置和分布,从而实现对细胞内特定蛋白质的定性和定量分析。
本文旨在提供一个通过甲醇通透的标准化的免疫荧光染色实验操作流程,以确保实验的可重复性和结果的准确性。通过遵循这些步骤,研究者能够有效地检测目标蛋白的表达和定位,进而深入了解其在生物学过程中的作用。正确的实验操作对于获得清晰、可靠的荧光图像至关重要,也是科研数据准确性和可靠性的基石。
一、固定
试剂
- 1× Phosphate Buffered Saline(PBS),调节pH=8.0。
- 新鲜配制的4%甲醛,不含甲醇。
实验操作
注:除非另有说明,否则所有后续孵育都在室温(20-25°C)下进行。
1、准备好样品,已固定好的冷冻组织可以直接进行第二步的免疫染色操作,如果是培养的细胞系或未固定的冷冻组织,需立即固定。
2、用4%的甲醛将样品完全覆盖,室温下固定15分钟。
3、用PBS漂洗三次,每次5分钟。
二、甲醇通透化
试剂
- 100%甲醇,使用冰冷溶液。
- 封闭缓冲液:购买即用型免疫荧光封闭液(B751639),或通过添加0.5 mL与二抗同一物种来源的正常血清(例如,正常山羊血清)和30 µL Triton X-100 到9.5 mL 1× PBS中来制备1× PBS /5%正常血清/0.3% Triton X-100缓冲液。4°C保存。
实验操作
1、甲醇通透化: 用冰冷的100%甲醇完全覆盖样本,然后在冰上或4°C下孵育10分钟。
2、用1× PBS漂洗三次,每次5分钟。
3、室温条件下,在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。
三、抗体孵育和成像
注:除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,否则所有随后的孵育都应当在室温下完成。
试剂
- 抗体稀释缓冲液: 购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液,或通过添加0.1 g BSA(B265994)和30 µL Triton X-100至10 mL 1× PBS中来制备1× PBS / 1% BSA /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C保存。
- 荧光素偶联的二抗。
实验操作
- 对于荧光标记一抗
1、用抗体稀释缓冲液制备一抗(可根据产品官网提供的建议稀释浓度配置)。
2、吸出封闭缓冲液,然后加入稀释后的一抗,4°C温度下孵育过夜。
3、用1× PBS漂洗三次,每次5分钟。
4、可根据实验需要进行适当的复染。
5、安装样品进行成像。
为了长期保存,请在4°C下避光保存样品。
- 对于非标记一抗
1、用抗体稀释缓冲液制备一抗(可根据产品官网提供的建议稀释浓度配置)。
2、吸出封闭缓冲液,然后加入稀释后的一抗,4°C温度下孵育过夜。
3、用1× PBS漂洗三次,每次5分钟。
4、用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后,避光孵育标本1-2小时。
5、用1× PBS漂洗三次,每次5分钟,注意避光。
6、可根据实验需要进行适当的复染。
7、安装样品进行成像。
为了长期保存,请在4°C下避光保存样品。
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