组蛋白的蛋白质印迹法
组蛋白的蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)与其他常规蛋白的蛋白质印迹实验在基本原理和操作步骤上是相似的,都依赖于特异性抗体来检测目标蛋白的存在和表达量。然而,由于组蛋白在细胞中的特殊性质和功能,实验过程中可能需要特别注意一些细节。
首先,在样本制备方面,组蛋白通常需要从细胞核中提取,这可能需要使用特定的核提取试剂,并且可能需要额外的步骤来纯化组蛋白。其次,电泳条件可能需要调整,因为组蛋白的分子量较小,可能需要调整SDS-PAGE电泳的浓度,以确保良好的分离效果。
在选择抗体时,需要使用针对特定组蛋白修饰(如乙酰化、甲基化)的抗体,这些修饰对组蛋白的功能至关重要。此外,由于组蛋白的表达量可能相对较低,可能需要使用更敏感的检测方法,如化学发光,以提高检测的灵敏度。
在选择内参蛋白时,应选择适合的内参蛋白,如Histone H3,以确保结果的准确性和可重复性。最后,在数据分析方面,可能需要使用特定的软件来分析组蛋白的修饰状态,这与分析常规蛋白的表达量有所不同。
在进行组蛋白的Western Blot实验时,确保实验条件的优化是关键,以确保结果的准确性和可靠性。
以下组蛋白印迹实验方案常用于检测源自纯化小牛胸腺的组蛋白。
操作步骤
1.每条泳道准备0.5 μg小牛胸腺或酸提取组蛋白,在含有100 mM DTT的1× LDS 样品缓冲液中稀释。
2.将样品加热至95°C,持续5分钟。
3.对样品进行短暂离心,以恢复管内形成的冷凝水造成的样品体积。
注意:请注意,来自细胞裂解物的蛋白质载量需要根据经验确定。
4.制备10% Bis-Tris 凝胶,厚度为1.0毫米。建议使用更高百分比的凝胶(如15%),以更有效地分离组蛋白。
5.组蛋白样品上样,记得包含预染色的蛋白质分子标准。
6.将凝胶放入MES-SDS电泳缓冲液中,以200 V的电压运行35分钟。
提示:处理较小的蛋白质分辨率时,建议不要让染料前端从凝胶中完全流出。
7.对于凝胶中的蛋白质转移,请参考转移装置提供的说明书进行,具体操作将根据所采用的转移方法(即半干印迹或湿印迹)而有所不同。
提示:一般30分钟到90分钟之间的转移时间应该足以实现有效的蛋白质转移;建议使用1×转移缓冲液/20%甲醇在30 V下转移70分钟。
注意:为了最佳地保留组蛋白,建议使用孔径为0.2毫米的硝酸纤维素膜。
8.使用丽春红染色验证组蛋白是否转移成功且载量均等。丽春红染料使用dH2O进行稀释。
9.使用5% BSA/0.1% TBST(50 mM Tris-HCl、 pH 7.5、150mM NaCl、0.1% Tween 20)在室温(RT)下封闭膜1小时。
10.如果需要,将膜切成条状,并按照官网数据表推荐的稀释度在封闭缓冲液(5% BSA /0.1% TBST)中稀释,制备一抗。
11.根据需要添加封闭肽(1 μg/ml),并在旋转平台上室温孵育20分钟。
12.将膜与一抗在室温下孵育1.5小时或在4°C下孵育过夜。
13.用0.1% TBST短暂冲洗膜,然后用相同的缓冲液清洗两次,每次5分钟,接着进行两次10分钟的清洗。
14.根据官网建议用1% BSA/0.1% TBST溶液稀释二抗,然后将膜与二抗在室温下孵育1小时 [例如Ab176443:山羊抗兔 IgG H&L(HRP)多克隆抗体]。
15.用0.1%TBST洗膜两次,每次5分钟,接着再洗两次,每次10分钟。
16.按照制造商的说明进行ECL、ECF或红外检测,例如在室温下添加ECL试剂3分钟,然后使用不同的曝光时间捕获WB图像:10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4 分钟和5分钟。
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